RIP

RIP实验技术

实验原理

RNA免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation，RIP）是一种研究RNA与蛋白质相互作用的实验技术。

基本原理是：在非变性条件下裂解细胞，保持RNA-蛋白质复合物的天然构象；利用特异性抗体识别并结合目标RNA结合蛋白（RBP），通过免疫沉淀将“蛋白-RNA”复合物从细胞裂解液中分离出来；经蛋白酶K消化去除蛋白质后，提取共沉淀的RNA；最后通过qRT-PCR检测特定RNA的富集情况，或通过高通量测序（RIP-seq）鉴定与目标蛋白结合的RNA分子。

该技术常用于研究RNA结合蛋白与特定RNA（如mRNA、lncRNA、非编码RNA）之间的相互作用，是解析转录后调控机制的重要手段。

（RIP实验原理图）

服务流程

客户咨询——方案/实验材料确认——样品制备——细胞裂解——免疫沉淀——RNA分离纯化—qPCR/seq——项目报告

实验流程

适用场景

1、RNA结合蛋白靶标鉴定：验证RBP是否结合特定mRNA、lncRNA或miRNA。

2、非编码RNA机制研究：研究lncRNA或circRNA与RBP的相互作用。

3、疾病机制：研究RBP在肿瘤、神经退行性疾病中的异常结合。

RIP实验 * 结果示例

实验步骤

1. 细胞裂解

①收集细胞，用预冷的PBS洗涤1次。

②加入适量RIP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂），冰上裂解10-15分钟。

③4℃离心，取上清（细胞裂解液）用于后续实验。

2. 抗体结合与磁珠准备

①取适量Protein A/G磁珠，用RIP洗涤缓冲液平衡2次。

②将磁珠与目标抗体或对照IgG混合，4℃旋转孵育1-2小时，使抗体结合至磁珠上。

③用洗涤缓冲液洗涤磁珠2次，去除未结合的抗体。

3. 免疫沉淀

①将抗体-磁珠复合物与细胞裂解液混合，4℃旋转孵育过夜（或至少4小时）。

②将离心管置于磁力架上，弃去上清。

③用洗涤缓冲液洗涤磁珠5-6次，每次洗涤后充分去除上清，以降低非特异性背景。

4. RNA提取与纯化

①向磁珠中加入蛋白酶K（含SDS），55℃孵育30-60分钟，消化蛋白质并释放RNA。

②使用TRIzol试剂或RNA提取试剂盒提取共沉淀的RNA。

③使用RNase-free DNase I处理RNA样本，去除残留DNA

5. 反转录与qPCR分析

①使用随机引物或Oligo(dT)将RNA反转录为cDNA。

②通过qRT-PCR检测目标RNA的富集水平，或通过文库构建进行高通量测序

参考文献

1、The EGR1-mediated lncRNA TENM3-AS1 potentiates gastric cancer metastasis via reprogramming fatty acid metabolism

2、CircAKT3 promotes prostate cancer proliferation and metastasis by enhancing the binding of RPS27A and RPL11

3、SNORA74A Drives Self-Renewal of Liver Cancer Stem Cells and Hepatocarcinogenesis Through Activation of Notch3 Signaling